近日,南通市第三人民醫(yī)院與蘇州銳訊生物科技有限公司運用銳訊DropX數(shù)字PCR平臺及試劑盒在大量樣本中開展了新冠肺炎檢測,數(shù)字PCR相較于熒光定量PCR體現(xiàn)出了顯而易見的高靈敏度,有效避免了痕量病毒攜帶病例出院風險,并有望為無癥狀感染檢測提供新方法。相關(guān)數(shù)據(jù)已發(fā)表在medRxiv。

隨著國內(nèi)疫情防控進入“下半場”,無癥狀感染者已引起中央高度重視。國家衛(wèi)健委宣布從4月1日起在每日疫情通報中公布無癥狀感染者情況。這對新冠病毒核酸檢測提出了更高要求。在南通市第三人民醫(yī)院的研究中,研究人員采用銳訊自主設(shè)計的4色數(shù)字PCR與檢測試劑盒,該試劑盒采用檢測病毒特有基因orf1AB(FAM熒光)和N基因(HEX熒光)以及一個人類基因(Cy5熒光)的手段,有效檢測病毒含量和樣本質(zhì)量,并能在一個反應(yīng)中進行三個靶基因的絕對定量檢測,最大程度地滿足高靈敏度COVID-19核酸檢測的需求,同時給出樣本質(zhì)量的相關(guān)數(shù)據(jù)。在此項研究中,采用數(shù)字PCR法檢測了109例來自于病人咽拭子,肛拭子和血漿樣本中新冠病毒的RNA載量。結(jié)果顯示數(shù)字PCR靈敏度和精度比熒光定量PCR至少高一個數(shù)量級,使COVID-19檢測具有更少的假陰性和假陽性結(jié)果,尤其是對于低病毒載量樣本(往往來自于無癥狀感染者,疑似病人和經(jīng)過治療接近治愈的病人)時展示了顯著的優(yōu)勢。文章展示了數(shù)字PCR在檢測無癥狀患者和疑似患者方面的強大功能的證據(jù)。
數(shù)字PCR能夠通過在PCR反應(yīng)中直接定量人類RNA的內(nèi)參基因的含量來檢測核酸反應(yīng),可以排除那些因為樣本上樣量不足造成的假陰性結(jié)果。同時文章將治療過程中的病人新冠病毒載量的變化用數(shù)字PCR和熒光定量PCR進行了對比,發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR能更穩(wěn)定和更準確地給出治療過程中病毒載量降低的變化趨勢。另外,文章中也對治療后兩次熒光定量PCR核酸陰性的病人樣本進項了復查,發(fā)現(xiàn)少數(shù)病例仍然帶有痕量的病毒,這可能也是某些出院病人核酸復陽的原因。銳訊四熒光數(shù)字PCR系統(tǒng) (FAM/HEX/CY5/ROX) 能夠在單個多路檢測中檢測更多目標基因,提供樣本中病毒載量的定量計數(shù),為新冠病毒的檢測提供了更精準,更靈敏的強大檢測手段?;驗榻鉀Q熒光定量漏檢問題提供更好方案。前銳訊生物也是國內(nèi)唯一推出4色數(shù)字PCR檢測設(shè)備和新冠COVID-19核酸數(shù)字PCR檢測試劑盒產(chǎn)品的商業(yè)公司,產(chǎn)品已經(jīng)在武漢火神山醫(yī)院、中國疾控、病毒學國家重點實驗室及多家定點醫(yī)院投入使用。


以下是此項研究中的部分實驗數(shù)據(jù):在檢測靈敏度的實驗中,對臨床樣本進行梯度稀釋并檢測(S1為原始濃度樣本,S2-S8為梯度稀釋樣本),并同時采用數(shù)字PCR和熒光定量PCR檢測,可以看到當樣本濃度逐漸降低的過程中,數(shù)字PCR可以檢測到2-3個拷貝的病毒核酸,且整體檢測線性關(guān)系更好。而熒光定量PCR在病毒核酸約為20-30左右時ct值為38.5,達到檢測限附近,且擴增的線性關(guān)系已經(jīng)發(fā)生較大偏離(上一個5倍的稀釋梯度的ct為35,如果使用ct差異來計算,應(yīng)為10倍差異)。
圖注:橘紅色為內(nèi)參基因,綠色為N基因,藍色為COVID-19 ORF1ab 基因。

S1樣本:熒光定量法 Ct=35 數(shù)字PCR法檢出


S3樣本:熒光定量法 未檢出 數(shù)字PCR法檢出

S4樣本:熒光定量法 未檢出 數(shù)字PCR法檢出

S5-8樣本:數(shù)字PCR與熒光定量均未檢出
同時,為了提升對待檢測樣本的質(zhì)量評估能力,銳訊試劑盒同步引入的Cy5通道作為內(nèi)參基因使用,在實際臨床樣本S13 樣本為一個新冠確診患者,已經(jīng)入院接受治療一段時間,接近治愈階段,醫(yī)院用qPCR和數(shù)字PCR對此例樣本進行檢測,來判斷核酸檢測是否為陰性,病人是否符合出院標準,qPCR 測出了N 和E基因陽性,ORF1ab 基因未檢出。ddPCR ORF1ab和N基因均陽性檢出,同時內(nèi)參基因濃度很高,證明這個樣本呈弱陽性,病毒載量很低。數(shù)字PCR結(jié)果顯示病人尚未符合出院標準,體內(nèi)仍殘留痕量病毒。出院可能會造成復發(fā),感染其他健康人群的風險。如果采用qPCR檢測結(jié)果,病人可能會被判為陰性而出院。

S13樣本:
左圖為orf1AB(FAM熒光)和N基因(HEX熒光)
右圖為orf1AB(FAM熒光)和人內(nèi)參基因(Cy5熒光)

S13樣本:熒光定量結(jié)果
根據(jù)上述對比數(shù)據(jù),同樣的試劑盒在銳訊數(shù)字PCR平臺上比qPCR平臺靈敏度高至少一個數(shù)量級,非常適合CDC或臨檢中心對新型冠狀病毒進行定量檢測;對有接觸史或高危地區(qū)無癥狀的“隱形病人”進行排查;對患者治療過程中的病毒載量變化進行動態(tài)檢測;對治愈病人進行核酸陰性確認,避免因為檢測靈敏度的問題漏檢某些仍然可能攜帶殘留病毒的病人。
研究中同時表明,某患者于2020年2月4日首次出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽和肌肉疼痛癥狀,然后于2020年2月13日住院。然而,在2月14日至2月25日所有6次RT-PCR測試中,RT-PCR的咽拭子呈陰性。CT結(jié)果顯示雙肺部都有感染。然而,由于陰性RT-PCR結(jié)果,患者被歸類為疑似病例。雖然數(shù)字PCR在2月14日,即患者攝入后的第二天出現(xiàn)陰性結(jié)果,但從2月18日起,樣本中報告SARS-CoV-2病毒載量低(ORF1ab基因濃度為0.34份/μl,N基因為0.43份/μl)。2月14日的陰性結(jié)果很可能是由于樣品加載不足。內(nèi)部參考基因的濃度僅為1.892拷貝/μl,表明測試中RNA負荷較低。2月18日,數(shù)字PCR檢測結(jié)果為陽性,內(nèi)部參考基因濃度為20.8拷貝/μl。研究還表明,2月14日dPCR結(jié)果為陰性,原因是RNA負荷不足,可能與樣品核酸萃取過程中樣品采集不當或RNA損失有關(guān)。CT掃描結(jié)果支持了數(shù)字PCR的結(jié)論,即該患者感染了新冠病毒,數(shù)字PCR核酸檢測為陽性。這名患者接受了莫西氟沙金、阿爾比多爾和普迪蘭的治療。
關(guān)于銳訊生物
銳訊生物(RainSure Scientific)成立于2017。創(chuàng)始團隊成員為來自美國常春藤盟校和頂尖大學的博士,擁有扎實的學術(shù)背景和豐富的工業(yè)界經(jīng)驗。核心團隊曾供職于業(yè)內(nèi)享有盛譽的老牌生物科技公司,多次參與和主導多款業(yè)內(nèi)知名產(chǎn)品的開發(fā)。自成立以來,銳訊生物秉承全球研發(fā)中國智造的理念,以創(chuàng)新、智造、助力健康為己任,專注于大健康領(lǐng)域的前沿技術(shù)創(chuàng)新與產(chǎn)品開發(fā)。

目前,銳訊生物產(chǎn)品涵蓋數(shù)字PCR系統(tǒng)、微流控解決方案兩大板塊。并在蘇州(蘇州銳訊生物科技有限公司)與美國分別建立了生產(chǎn)基地。銳訊生物在國際上屢獲佳評,曾獲中國科協(xié)首屆海外創(chuàng)業(yè)大賽美西組冠軍、2018年蘇州工業(yè)園區(qū)創(chuàng)業(yè)型領(lǐng)軍企業(yè)、2018年姑蘇創(chuàng)業(yè)天使企業(yè)、2018年江蘇省留學回國人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目立項單位、2019年江蘇省高新技術(shù)企業(yè)培育庫等多項榮譽,并先后獲得真格基金、火山石資本、明勢資本、元生創(chuàng)投等國內(nèi)外知名機構(gòu)投資。
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